产品简介

本产品结合了饱和染料EvaGreen 和抗体酶的优点，是一款适用于高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）分析的专业试剂盒。本品是一种2× PreMix，PCR 反应液配制十分简单方便；具有分辨率高和模板高度适应性等特点。与SYBR Green 不同，EvaGreen 在高浓度情况下不会抑制PCR 反应；可以使双链PCR 产物的结合量达到饱和状态，所以称为“饱和染料”。不会产生SYBR Green 的“染料重排”现象，能够很好的区分扩增产物之间单个碱基的差异。本产品可用于已知SNP 分析，未知SNP 筛选，以及未知突变基因扫描和甲基化PCR 分析等研究。

产品特点

■ 高分辨率：采用EvaGreen 饱和染料，在饱和状态下具很高的熔解曲线分辨率，可以区分单个碱基的变异。

■ 高特异性：采用抗体修饰的热启动DNA 聚合酶，降低非特异性扩增，提高特异性。

■ 高稳定性：精心优化Buffer 体系，增加了熔解曲线的稳定性，提高结果可信度。

■ ROX 校正：单独包装的ROX 染料，使用更灵活，结果更准确。

储存条件

收到本产品后， 请立即置于-20 ℃ 避光保存。从-20 ℃ 取出使用时， 将冻存的2x HRM Analysis PreMix和50×ROX Reference Dye溶解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻(在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用，可在2～8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。

注意事项

1．本产品中含有荧光染料EvaGreen，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。

2．如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀，请不要使用振荡器进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。

3．引物纯度对反应特异性影响很大，建议使用PAGE级别以上纯化的引物。

4．20 μl反应体系中，基因组DNA模板的使用量一般小于100 ng，并尽量保持不同反应之间有相同的模 量。模板纯度，OD_260/280 1.6~2.0，OD_260/2301.5~2.0。

5．由于HRM具有很高的灵敏性，因此在条件允许的情况下推荐使用50 ul反应体系，大的反应体系可以提高反应重复性，减少实验误差对熔解曲线的负面影响。

6．引物设计：较短的PCR产物可以提高HRM的分辨率；因此在设计PCR引物时，遵循普遍的原则外，尽量保持产物长度在80~120之间。SNP位点尽量处在PCR产物序列中间位置。

实验例

使用DP318 提取100 μl 人类血液样本，上样量50 ng，根据NCBI SNP 数据库，选取FEN1 基因的已知SNP (rs174538) 使用Roche LightCycle480 检测，结果如下：

实验结果显示，HRM Analysis Kit 的相同基因型熔解曲线重复性高，不同基因型分辨明确，不存在误判，是理想的

SNP 位点分析方法。

SNP 信息：......CGGAAGAACACGTCG[A/G]CAGGAGCAGGCGCCT...... （Allele Frequency：A=0.314，G=0.686）

引物：扩增108 bp 的片段（所用引物FEN1_F：CCTCAACGCTCTCACCATTTTG；FEN1_R：GGCACTTCCTTTTCCGGTTGTG）

实验例

根据NCBI SNP 数据库，选取已知的SNP 进行检测，检测的SNP 信息如下：

RefSNP number：rs174538Gene Name：FEN1 （flap structure-specific endonuclease 1）序 列：CGCTCCGCCACCGGAAGAACACGTCG[A/G]CAGGAGCAGGCGCCTAGCACAACCGAllele Frequency：A=0.314，G=0.686根据该SNP 位点两侧序列信息，设计引物：FEN1_F：CCTCAACGCTCTCACCATTTTG；FEN1_R：GGCACTTCCTTTTCCGGTTGTG；扩增PCR 产物长度为108 bp。配置反应体系，在Roche LightCycle480 仪器上运行，检测24 个个体，结果如下：

图1. 对已知SNP 进行检测，NCBI Assay ID 为ss869699；PCR 产物长度为108 bp；24 个检测样本。Roche LightCycler480 仪器运行, 收集熔解曲线信号参数：Ramp Rate 0.05；Acquisitions 12； Gene scanning 方法分析。结果中可以看出，HRM Analysis Kit 的不同基因型分辨明确，相同基因型熔解曲线重复性高，不存在误判。

仪器要求

HRM 对仪器的要求较高，ABI 7500 Fast ，ABI 7900HT，Roche LightCycler 480，Qiagen Roter-Gene 等配合专用软件可进行HRM 实验。